活性氧檢測(cè)試劑盒Reactive oxygen species assay kit
規(guī)格：100-500T
產(chǎn)品簡(jiǎn)介：
活性氧(Reactive oxygen species, ROS) 包括超氧自由基、過氧化氫、及其下游產(chǎn)物過氧化物和羥化物(O2•
−
,
H2O2, •OH, ONOO
−
, •NO)等，參與細(xì)胞生長(zhǎng)增殖、發(fā)育分化、衰老和凋亡以及許多生理和病理過程。采用
2,7-dichlorofluorescin diacetate (DCFH-DA)是迄今常用、靈敏的細(xì)胞內(nèi)活性氧檢探針。DCFH-DA沒有熒光，
進(jìn)入細(xì)胞后被酯酶水解為dichlorofluorescin (DCFH)。在活性氧存在時(shí)DCFH被氧化為不能透過細(xì)胞膜的強(qiáng)綠色
熒光物質(zhì)dichlorofluorescein (DCF)，其熒光在激發(fā)波長(zhǎng)502 nm，發(fā)射波長(zhǎng)530 nm附近有大波峰，強(qiáng)度與細(xì)
胞內(nèi)活性氧水平成正比。此活性氧檢測(cè)系統(tǒng)本底低，靈敏度高，重復(fù)性好，操作簡(jiǎn)便。
本試劑盒適于熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡等圖像檢測(cè)，和微板熒光分析儀(multiwell fluorescence plate
reader)、流式細(xì)胞儀定量ROS檢測(cè)。
工作波長(zhǎng)：
佳激發(fā)波長(zhǎng)500、485 (500 ±15 nm)，佳發(fā)射波長(zhǎng)525 (530 ±20 nm)。也可按照FITC熒光檢測(cè)條件
檢測(cè)。
活性氧檢測(cè)試劑盒操作步驟：
一、試劑準(zhǔn)備：
1. DCFH-DA可稀釋于培養(yǎng)基或緩沖液中。血清或培養(yǎng)基顏色并不影響DCFH-DA及細(xì)胞內(nèi)熒光產(chǎn)生，但
可能會(huì)影響熒光顯微鏡觀察，干擾熒光分光光度計(jì)、熒光酶標(biāo)儀或流式細(xì)胞儀熒光測(cè)定?？蓪CFH-DA稀
釋于無酚紅培養(yǎng)基或適宜的緩沖液如PBS中。這依賴于使用何種熒光設(shè)備進(jìn)行測(cè)定。
2. 加入DCFH-DA的時(shí)機(jī)或孵育時(shí)間，以終能順利檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧為目的。藥物處理時(shí)間較短(<2
小時(shí))或預(yù)計(jì)ROS效應(yīng)較弱，可先加或同時(shí)加入DCFH-DA。反之，treat 刺激時(shí)間較長(zhǎng)(>6 小時(shí))或預(yù)計(jì)產(chǎn)生
ROS效應(yīng)較強(qiáng)，可后加DCFH-DA。
3. 活性氧供體含高純度12 mM H2O2。加入細(xì)胞后其本身即是一種活性氧，而且在代謝過程中可產(chǎn)生其
它類型的活性氧，均可使DCFH-DA氧化為DCF呈現(xiàn)強(qiáng)綠色熒光。因而，用戶可使用該試劑作為測(cè)試實(shí)驗(yàn)系
統(tǒng)或儀器的陽性試劑，以初步觀察細(xì)胞活性氧所產(chǎn)生的熒光的一般特征，并且也可以將該實(shí)際作為實(shí)驗(yàn)的一
個(gè)陽性對(duì)照。推薦該試劑的細(xì)胞工作濃度為20~100 µM或更低濃度，但超過200µM將產(chǎn)生細(xì)胞毒。如果用
戶熟悉ROS熒光或?qū)嶒?yàn)沒有必要采用陽性對(duì)照，可以不加該試劑。
二、加入熒光探針：
1. 加入DCFH-DA于培養(yǎng)基，推薦初始工作濃度為10 µM。對(duì)不同的細(xì)胞和處理，DCFH-DA工作濃度
可為100 nM~20 µM，需進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)確定合適的濃度。總體稀釋倍數(shù)應(yīng)在1:500~1000以上以避免DMSO對(duì)細(xì)
胞的影響。以DMSO作為溶劑對(duì)照。
2. 37 ºC 孵育細(xì)胞30min~幾個(gè)小時(shí)，通常30-60min 即可。孵育時(shí)間長(zhǎng)短與細(xì)胞類型、刺激條件、
DCFH-DA濃度有關(guān)。
3. PBS洗滌細(xì)胞2次。
三、活性氧檢測(cè)試劑盒熒光檢測(cè)
采用熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡圖像檢測(cè)照相，綠色熒光強(qiáng)度代表活性氧水平。也可進(jìn)行微板熒光
分析儀(multiwell fluorescence plate reader)實(shí)時(shí)或每10分鐘分時(shí)逐點(diǎn)檢測(cè)熒光強(qiáng)弱。對(duì)于流式細(xì)胞儀可將細(xì)胞
用胰酶消化PBS洗滌后重懸檢測(cè)。 |
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